โครงการวิจัยการศึกษาความหลากหลายและการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ

บทคัดย่อ

มันสำปะหลังเป็นพืชส่งออกที่สำคัญและมีบทบาทสำคัญเพิ่มขึ้นเพราะเป็นพืชพลังงานเป็นวัตถุดิบในการผลิตเอทานอลจากแป้งจึงเป็นพืชที่มีความต้องการสูงมากในปัจจุบัน ในการผลิตมันสำปะหลังของเกษตรกรโดยทั่วไปยังใช้เทคนิคดั้งเดิม ประกอบกับพื้นที่ในการผลิตเสื่อมโทรมลง การนำเทคโนโลยีชีวภาพมาพัฒนาด้านการปรับปรุงพันธุ์และด้านอื่น ๆ จึงมีความจำเป็น โครงการวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างความหลากหลายทางพันธุกรรมของมันสำปะหลังโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เพื่อศึกษาความหลากหลายของพันธุ์มันสำปะหลังในประเทศไทยโดยใช้เทคนิคชีวโมเลกุล การพัฒนาโมเลกุลเครื่องหมายสำหรับการตรวจสอบลักษณะสำคัญทางเศรษฐกิจ การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับลักษณะที่สำคัญทางเศรษฐกิจของมันสำปะหลัง การรวบรวม ศึกษา ปรับปรุงสายพันธุ์จุลินทรีย์ที่มีประโยชน์ ด้วยเทคนิคพันธุวิศวกรรม การถ่ายยีนเข้าสู่มันสำปะหลังสำหรับการปรับปรุงพันธุ์และจัดทำระบบชีวสารสนเทศศาสตร์ของมันสำปะหลัง การสร้างพันธุ์มันสำปะหลังเตทราพลอยด์โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ใช้ตาข้างและตายอดของมันสำปะหลังพันธุ์ระยอง7 ระยอง9 และเกษตรศาสตร์50 อายุ 30-45 วัน ฟอกฆ่าเชื้อที่ผิวเพาะเลี้ยงบน MS medium ผสมซูโครส 20 ก./ลิตร 30-45 วัน ได้ต้นกล้ามันสำปะหลังที่สมบูรณ์ ใช้เป็น explant สำหรับชักนำให้เป็นโพลิพลอยด์ โดยวิธีการเพาะเนื้อเยื่อร่วมกับโคลชิซินเข้มข้น 0.002-0.003% ผสม DMSO 2% explant ที่มีชีวิตรอด จำนวน 33-58% สามารถเจริญและพัฒนาต่อไปเป็นต้นกล้า โพลิพลอยด์มีต้นเตี้ย ข้อถี่ ใบหนา เขียวเข้ม หยักเว้าน้อย การเจริญเติบโตช้า มีรากใหญ่และสั้น การคัดเลือกมันสำปะหลังโพลิพลอยด์ในสภาพปลอดเชื้อโดยวิธีการตัดเป็นข้อๆ ละ 1 ตา ปฏิบัติซ้ำทุก 4-6 ชั่วโมง จะได้ต้นกล้ามันสำปะหลังโพลิพลอยด์ที่ไม่มีลักษณะ Chimera 100% สามารถผลิตต้นมันสำปะหลังที่มีโครโมโซมแบบโพลีพลอยด์ได้ 1 ต้น และเก็บรักษาไว้ที่เรือนเพาะต้นไม้สถาบันวิจัยพืชไร่เพื่อนำไปพัฒนาให้เป็นต้นมันที่สมบูรณ์ต่อไป การศึกษาความหลากหลายของพันธุ์มันสำปะหลังในประเทศไทยโดยใช้เทคนิค SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความหลากหลายของพันธุ์มันสำปะหลังที่สำคัญของไทย 15 สายพันธุ์ ทำการทดสอบ PCR โดยใช้ไพร์เมอร์แบบสุ่ม RAPD ขนาด 10 เบส จำนวน 122 สาย ได้ไพร์เมอร์ 13 สาย ที่สามารถแยกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์มันสำปะหลัง แล้วคัดเลือกชิ้นดีเอ็นเอเป้าหมายที่ให้ความแตกต่างในแต่ละสายพันธุ์ได้จำนวน 32 แถบ นำมาโคลนเข้าสู่เวคเตอร์เพื่อหาลำดับเบส แล้วออกแบบไพร์เมอร์ที่จำเพาะเจาะจงจากปลาย 5’ ของดีเอ็นเอทั้ง 2 สาย ได้ไพร์เมอร์ SCAR ได้แก่ 4 คู่สาย JDOA45-4, JDOA2, JDOAC3 และ JDOA4 นำมาจำแนกมันสำปะหลัง 15 พันธุ์ พบว่า JDOA2 สามารถจำแนกลักษณะจำเพาะทางจีโนไทป์ของพันธุ์ระยอง 2 ได้ชิ้นดีเอ็นเอขนาด 986 เบส และคู่ไพร์เมอร์ JDOA4 จำแนกมันสำปะหลังพันธุ์ระยอง 60 และ พันธุ์ห้านาที ได้ชิ้นดีเอ็นเอขนาด 922 เบส เมื่อนำแถบดีเอ็นเอที่ได้จากไพร์เมอร์ SCAR มาวิเคราะห์หาความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมสามารถแบ่งกลุ่มพันธุ์มันสำปะหลังออกเป็น 2 กลุ่มใหญ่ ได้แก่ กลุ่ม 1 ประกอบด้วย พันธุ์ระยอง 1/1, ระยอง 1/2, ระยอง 2, ระยอง 5, CMR 35 และ CMR 36 กลุ่ม 2 ประกอบด้วยพันธุ์ระยอง 3, ระยอง 7, ระยอง 9, ระยอง 60, ระยอง 72, ระยอง 90, เกษตรศาสตร์ 50, ห้วยบง 60 และพันธุ์ห้านาที การศึกษาความแตกต่างทางพันธุกรรมของมันสำปะหลังไทยต้านทานโรคแบคทีเรียลไบลท์โดยใช้ยีนเปอร์ออกซิเดส วัตถุประสงค์ของการทดลองนี้เพื่อนำยีนที่โคลนได้จากการศึกษาก่อนหน้านี้ ได้แก่ ซีเครททอรีเปอร์ออกซิเดส (PX3) และยีนแคทไอออนนิกเปอร์ออกซิเดส (MPER1) มาใช้เป็นยีนโพรบหรือยีนติดตาม ด้วยวิธีการจีโนมิกเซาเทิร์นบลอทไฮบริไดซ์เซชั่น (Genomic southern blot hybridization) และใช้สารปลอดรังสีเป็นสารติดฉลาก (Chemiluninescent) ผลการทดลองให้ผลบวก การทดลองนี้สามารถประยุกต์ใช้หรือนำวิธีการจีโนมิกเซาเทิร์นบลอทมาใช้ในการระบุหายีนในระดับจีโนมต่อไปได้ โรคแบคทีเรียไบลท์หรือโรคใบไหม้ (Cassava Bacterial Blight, CBB) เชื้อสาเหตุคือ Xanthomonas ampestris pv. Manihotis เครื่องหมายโมเลกุลที่ให้ความแตกต่างระหว่างพันธุ์ต้านทานและอ่อนแอต่อโรคแบคทีเรียลไบลท์ในมันสำปะหลัง การทดลองนี้ได้ตรวจสอบความแตกต่างของดีเอ็นเอระหว่างพันธุ์มันสำปะหลังที่ต้านทาน (1ระยอง 90 2ระยอง 9) และพันธุ์อ่อนแอ (3ระยอง 5) พันธุ์ ต่อโรคแบคทีเรียลไบลท์ ด้วยเครื่องหมายโมเลกุลชนิด microsatellite ที่พัฒนาจากมันสำปะหลัง และ EST-SSR ที่พัฒนาจากยางพารา ผลการทดสอบพบเครื่องหมายโมเลกุลพบไพรเมอร์ที่ให้รูปแบบของแถบดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน จำนวน 50 คู่ไพรเมอร์ ได้แก่ SSRY1 SSRY5 SSRY8 SSRY10 SSRY12 SSRY13 SSRY19 SSRY20 SSRY21 SSRY23 SSRY32 SSRY34 SSRY40 SSRY45 SSRY50 SSRY51 SSRY61 SSRY62 SSRY64 SSRY66 SSRY69 SSRY70 SSRY79 SSRY86 SSRY90 SSRY91 SSRY95 SSRY96 SSRY97 SSRY100 SSRY101 SSRY102 SSRY103 SSRY105 SSRY106 SSRY120 SSRY128 SSRY143 SSRY155 SSRY178 SSRY181 emHbDOA63 emHbDOA78 emHbDOA175 emHbDOA177 emHbDOA178 emHbDOA185 emHbDOA187 emHbDOA190 และ emHbDOA196 โดยไพรเมอร์เหล่านี้สามารถนำไปวิเคราะห์หาความเกี่ยวข้องกับลักษณะการต้านทานต่อแบคทีเรียลไบลท์ในมันสำปะหลัง โดยใช้ประชากรที่เกิดจากการผสมระหว่างพันธุ์ต้านทาน และพันธุ์อ่อนแอ เครื่องหมายโมเลกุลที่ให้ความแตกต่างระหว่างพันธุ์ที่เก็บผลผลิตได้เร็วและช้าในมันสำปะหลัง ได้ค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลที่ให้ความแตกต่างระดับดีเอ็นเอของพันธุ์มันสำปะหลังที่ให้ผลผลิตเร็ว (ระยอง 60) และพันธุ์ที่ให้ผลผลิตช้า (ระยอง 72) โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลชนิด microsatellite ที่พัฒนาจากมันสำปะหลัง และ EST-SSR ที่พัฒนาจากยางพารา ผลจากการทดลองพบเครื่องหมายโมเลกุลที่ให้ขนาดของแถบดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน จำนวน 48 คู่ไพรเมอร์ ได้แก่ SSRY1 SSRY5 SSRY8 SSRY10 SSRY12 SSRY13 SSRY19 SSRY20 SSRY21 SSRY23 SSRY32 SSRY34 SSRY40 SSRY45 SSRY50 SSRY51 SSRY61 SSRY62 SSRY64 SSRY66 SSRY69 SSRY70 SSRY79 SSRY86 SSRY90 SSRY91 SSRY95 SSRY96 SSRY97 SSRY100 SSRY101 SSRY102 SSRY103 SSRY105 SSRY106 SSRY120 SSRY128 SSRY143 SSRY155 SSRY178 SSRY181 emHbDOA63 emHbDOA78 emHbDOA175 emHbDOA177 emHbDOA178 emHbDOA185 emHbDOA187 emHbDOA190 และ emHbDOA196 ซึ่งไพรเมอร์ดังกล่าวนี้เหล่านี้สามารถนำไปใช้วิเคราะห์หาความเกี่ยวข้องกับลักษณะการให้ผลผลิตเร็วในมันสำปะหลัง โดยใช้ประชากรที่เกิดจากการผสมระหว่างพันธุ์ให้ผลผลิตเร็ว กับพันธุ์ที่ให้ผลผลิตช้า การคัดเลือกพันธุ์มันสำปะหลังที่มีปริมาณสารไซยาไนด์ต่ำด้วยวิธีการชีวเคมีและเทคนิคโมเลกุลพบว่าการแสดงออกของยีน cypD1, cypD2 และ linamarase ที่ยอดในต้นอายุ 1 เดือน มีความสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณไซยาไนด์ที่พบในยอดอายุ 1 เดือน และหัวอายุ 12 เดือน สามารถแสดงความแตกต่างในการผลิตไซยาไนด์ของแต่ละพันธุ์ได้ในขณะที่ยังเป็นต้นอ่อน โดยทำการทดสอบ จากผลการแสดงออกของยีน cypD1, cypD2 และ linamarase ที่ยอดในต้นอายุ 1 เดือน มีความสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณไซยาไนด์ที่ในหัวมันสำปะหลังอายุ 12 เดือน . สามารถใช้การแสดงออกของยีน cypD1 ในใบอ่อนของต้นอายุ 1 เดือน ในการคัดเลือกต้นที่มีไซยาไนด์สูงหรือต่ำได้. ค่า R2 ที่ต่ำเกิดจาก outliner บางตัวอย่างที่ปริมาณไซยาไนด์ไม่สอดคล้องกับการแสดงออกของยีนสาเหตุหลักเกิดจากสภาพแวดล้อมที่ส่งผลต่อกลุ่มประชากรลูกผสมที่ตรวจสอบการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังเพื่อแป้งสูงโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลคัดเลือกพันธุ์ I..แผนที่พันธุกรรม การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลเพื่อใช้คัดเลือกพันธุ์มันสำปะหลัง ตั้งแต่ ปี 2549-53 ได้สร้างแผนที่พันธุกรรมมันสำปะหลังจากประชากรลูกผสมชุดที่ 1 ระหว่างพันธุ์ห้านาทีกับห้วยบ่ง 60 และประชากรลูกผสมชุดที่ 2 ระหว่างพันธุ์ห้วยบ่ง 60 กับพันธุ์5นาที แผนที่พันธุกรรมของประชากรลูกผสมชุดที่ 1 ประกอบด้วยเครื่องหมายพันธุ์กรรมทั้งสิ้น 317 เครื่องหมาย บน 29 กลุ่มเครื่องหมาย ครอบคลุม 1,481.42 cM และมีค่าเฉลี่ยระยะระหว่างเครื่องหมาย 6.10 cM ส่วนแผนที่พันธุกรรมลูกผสมชุดที่ 2 นั้นประกอบด้วยเครื่องหมายพันธุกรรมทั้งสิ้น 373 เครื่องหมาย บน 27 กลุ่มเครื่องหมาย ครอบคลุม 1,283.6 cM และมีค่าเฉลี่ระยะระหว่างเครื่องหมาย 6.27 cM แม้ว่าแผนที่พันธุกรรมที่ถูกสร้างขึ้นนั้นจะยังไม่ครอบคลุมทั้งจีโนมมันสำปะหลัง อย่างไรก็ตาม แผนที่ทั้งสองก็ครอบคลุมมากกว่า 80 เปอร์เซ็นต์ของจีโนมและมีค่าเฉลี่ยระยะระหว่างเครื่องหมายน้อยกว่า 10 cM ซึ่งสามารถนำมาใช้ในการวิเคราะห์หาตำแหน่งที่สัมพันธ์กับลักษณะเชิงปริมาณ QTL ได้อย่างมีประสิทธิภาพ การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับการต้านทานโรคแบคทีเรียลไบลท์ ซึ่งเป็นโรคใบไหม้ของมันสำปะหลัง (Cassava bacterial blight, CBB) มีสาเหตุมาจากเชื้อแบคทีเรีย Xanthomonas ampestris pv. manihotis ในการศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อโคลนยีนเปอร์ออกซิเดส (Peroxidases) จาก มันสำปะหลังพันธุ์ระยอง 60 (MTAI 60) ซึ่งเป็นพันธุ์ต้านทานโรคใบไหม้จำนวน 2 ยีน ได้แก่ Cationic peroxidase (MPER1) และ Secretory peroxidase (PX3) ผลการศึกษาพบว่าเหมือนกับลำดับนิวคลิโอไทด์ของ MPER1 (Genbank accession number EF645823) มีขนาด 1,211 นิวคลิโอไทด์ (98 กรดอะมิโน) ประกอบด้วย 2 exons และ 1 intron ส่วนลำดับนิวคลิโอไทด์ของ PX3 (GenBank accession number EF645824) มีขนาด 945 นิวคลิโอไทด์ (134 กรดอะมิโน) ประกอบด้วย 3 exons และ 2 introns ยีนทั้งสองแสดง Conserved domain กับเปอร์ออกซ…

คำสำคัญ